.

TESIS DE POST-GRADO

Caracterización de c-FLIP (Cellular flice-like inhibitory protein) como biomarcador de diagnóstico y/o progresión de lesiones preneoplásicas y neoplásicas del cuello uterino.

Carmen Gloria Ili. Doctorado UFRO. 2012

Resumen

Introducción: El Cáncer Cervicouterino es una de las principales causas de muerte por cáncer en mujeres a nivel mundial, siendo la infección por HPV un evento precursor en esta enfermedad. Las técnicas de screening no permiten identificar al 1% de mujeres infectadas por HPV que evolucionarán hasta carcinoma invasor. c-FLIP (Cellular FLICE- like inhibitory protein) se encuentra sobreexpresado en varios tipos de cáncer y podría estar asociado con la progresión del cáncer cervical, debido a que es capaz de regular la apoptosis, postulándolo como potencial biomarcador de detección temprana y/o progresión del cáncer cervicouterino.

Hipótesis: La sobreexpresión de c-FLIP contribuye a la progresión de lesiones preneoplásicas y neoplásicas del cuello uterino y por tanto su detección permite el diagnóstico temprano de lesiones incipientes del cérvix y selecciona grupos de pacientes con mayor probabilidad de progresión a cáncer.

Objetivo: Caracterizar la participación de c-FLIP en la carcinogénesis cervical y determinar si la sobreexpresión de esta proteína puede ser utilizada como un potencial biomarcador de diagnóstico y/o progresión en cáncer cervicouterino.

Metodología: Se realizó un perfil inmunohistoquímico de c-FLIP en biopsias de lesiones preneoplásicas y neoplásicas del cuello uterino y se evaluó el genotipo viral infectante mediante reverse line blot. En líneas celulares de cuello uterino se estudió el perfil de expresión de c-FLIP a través de Real Time PCR y Western Blot. Posteriormente se reprimió esta proteína mediante siRNA y lipofección, para realizar estudios funcionales in vitro de viabilidad celular, proliferación y apoptosis.

Resultados: Hubo un aumento significativo de la expresión de c-FLIP desde muestras normales (12,5%) a cáncer (82,1%)(p<0,001). Se encontró asociación entre la expresión alta de c-FLIP e infección por HPV de alto riesgo (p<0,001). El knock down de la expresión de c-FLIP en líneas celulares de cáncer de cuello uterino aumenta la viabilidad, la proliferación y la apoptosis. Conclusiones: c-FLIP participa en la carcinogénesis cervical regulando la apoptosis, por lo cual podría considerarse tanto un potencial biomarcador de progresión, como un posible blanco terapeútico en cáncer de cuello uterino.


Utilización de la tecnología MeDIP-Chip para la identificación de genes con hipermetilación aberrante en la selección de posibles candidatos a biomarcadores en cáncer cervico uterino.

Priscila Brebi Mieville. Doctorado UFRO. 2011

Resumen

A nivel mundial, se diagnostican anualmente medio millón de nuevos casos de cáncer cervical uterino (CCU), falleciendo la mitad de pacientes por esta causa. Un 80 % de los CCU son diagnosticados en países en desarrollo. En Chile, el cáncer cervical es la enfermedad mortal más frecuente en mujeres entre 35 y 54 años, reportándose cerca de 1300 casos y 676 muertes cada año, con una tasa de mortalidad de 8,3 mujeres por cada 100.000 habitantes. La asociación entre Virus Papiloma Humano (HPV) y CCU es ampliamente conocida y aceptada. De los 200 tipos de HPV descritos hasta ahora, los de alto riesgo oncogénico corresponden aproximadamente a 18 subtipos y son responsables de casi la totalidad de casos de CCU (99,7%).

Actualmente, el sistema de tamizaje para la detección precoz del cáncer de cuello uterino es el Papanicolau (PAP), el cual se basa en la citología exfoliativa del cuello uterino, con una sensibilidad que no supera el 50-60% de los casos. Por otra parte, este sistema de tamizaje no permite identificar los casos que progresarán desde lesiones preneoplásicas a lesiones invasoras, esto debido a que sólo el 1-2% de las mujeres infectadas con HPV de alto riesgo desarrollará lesiones de alto grado o carcinomas invasores, ya que una serie de factores no dilucidados inherentes al huésped, juegan un rol crítico en el desarrollo de esta neoplasia. Por lo tanto, la identificación de biomarcadores altamente sensibles, con alto valor predictivo para diagnóstico precoz, progresión y selección terapéutica de lesiones cervicales uterinas, constituye un enfoque de gran utilidad clínica para la identificación de mujeres con riesgo de desarrollar CCU. En la carcinogénesis cervical, ocurren una serie de alteraciones epigenómicas, tanto en el virus causal HPV como en el genoma del huésped, que incluyen hipometilación global, hipermetilación aberrante de las áreas promotoras de genes supresores de tumor, remodelación de la cromatina y modificación de histonas. Estudios con animales y humanos, han demostrado que estos cambios, son un evento temprano en la carcinogénesis y están a menudo presentes en las lesiones precursoras de una gran variedad de cánceres. Debido a ello, la hipermetilación aberrante de las áreas promotoras de genes supresores de tumor, podría ser utilizada como un biomarcador epigenómico de diagnóstico y progresión en la carcinogénesis del cuello uterino.

Hipótesis: En la carcinogénesis cervical uterina, la hipermetilación aberrante de las áreas promotoras de genes supresores de tumores es un evento frecuente, que se observa tanto en lesiones preneoplásicas como neoplásicas, en forma secuencial y acumulativa, diferencialmente asociada a distintos genotipos de HPV. Por lo que la identificación de estas alteraciones en forma aislada y/o en grupos de genes podría ser utilizado como biomarcador para diagnóstico precoz, progresión y pronóstico de CCU.

Objetivo: Identificar y validar biomarcadores epigenómicos de diagnóstico y progresión en la carcinogénesis del cuello uterino y su relación con diferentes genotipos de HPV, mediante la determinación de estados diferenciales de hipermetilación aberrante de las áreas promotoras de genes supresores de tumores en tejido normal, lesiones preneoplásicas y neoplásicas.

Metodología: Tipificación: Para describir los tipos virales (HPV) presentes en distintos estados de progresión de la carcinogénesis cérvico uterina, se realizará una tipificación mediante la técnica reverse line blot (RLB) en tejido cervical uterino normal (23 casos), lesiones preneoplásicas (163 casos) y neoplásicas (40 casos). Screening: Para identificar genes candidatos que presenten estado diferencial de hipermetilación aberrante de las áreas promotoras de genes supresores de tumor, se realizará un screening mediante Microarreglos de Metilación en tejido normal (12 casos) y tejido tumoral (7 casos). Validación: Posteriormente el estado traduccional de estos genes será validado con inmunohistoquímica y la frecuencia de metilación con Methylation specific PCR (MSP). El perfil inmunohistoquímico se obtendrá utilizando matrices de tejido (TMA) en tejido normal (59 casos), lesiones preneoplasicas (476 casos) y neoplásicas (63 casos). Las frecuencias de metilación se realizarán mediante la Methylation Specific PCR (MSP) en tejido normal (25 casos), lesiones preneoplásicas (157 casos) y neoplásicas (39 casos).

Resultados: Los microarreglos de metilación permitieron identificar cinco genes como potenciales biomarcadores, GGTLA4, FKBP6, ZNF516, SAP130 e INTS1. Estos genes fueron seleccionados debido a que presentaron un alto SCORE de metilación en las muestras de Cáncer y no en las normales. Posteriormente se evaluó el estado de metilación en de los genes en tejido normal, lesiones preneoplásicas y neoplásicas, mediante metilación gen específico, obteniendo un comportamiento similar para todos los genes, ya que la frecuencia de metilación aumentó a medida que progresaba la lesión cervical uterina. Al evaluar la expresión mediante IHQ, solo se observó una disminución en las proteínas ZNF516 y GGTLA4. .


Detección molecular de HPV(genes L1 y E6-7) y su asociación con P53 y p16 en carcinomas de cabeza y cuello.

Pamela Villalobos. Magister U.Valparaiso. 2010

Resumen

Los carcinomas escamosos de cabeza y el cuello cobran cada vez más importancia y la estimación mundial es de 615 mil nuevos casos con 330 mil muertes. Los principales factores de riesgo son el consumo de tabaco y alcohol, sin embargo hay otros factores involucrados, donde destaca la presencia del virus papiloma humano (HPV). La asociación de este virus con el cáncer de cuello uterino y otros cánceres anogenitales está ampliamente reconocida y en el caso de carcinomas de cabeza y cuello su importancia es más reciente pero su importancia es creciente. Se reportan prevalencias de HPV de alto riesgo entre 25 a 68% en cáncer bucofaríngeo y en cáncer bucal de 43% lo que indicaría un aumento en la prevalencia en los últimos años.

El rol del HPV en cáncer orofaríngeos está empezando a ser dilucidado y uno de los hallazgos importantes es la observación que los cánceres HPV positivos son clínicamente diferentes en comparación con los cánceres de HPV negativos, especialmente en relación con la respuesta al tratamiento y a la sobrevida de los pacientes. Una de las explicaciones que se postula para esta diferencia sería que la interacción de las oncoproteínas virales E6 y E7 con las proteínas del huésped p53 y pRb, respectivamente, que facilitaría el control del proceso cancerígeno.

En los tumores HPV positivos la oncoproteína viral E7 interactúa con la p53 dejándola en forma nativa o mutada pero sin alterarle su funcionalidad; esto se traduciría en una menor expresión de ciclina D1 y pRb y habría en consecuencia una sobreexpresión de p16. En cambio los tumores HPV negativos presentarían mutaciones funcionales de p53, con aumento de la expresión de ciclina D1, habría niveles normales o aumentados de pRb y expresión disminuida de p16. Últimamente las interacciones de las onconproteínas virales con las proteínas del huésped favorecerían el proceso de apoptosis inducida por la radioterapia.

En Chile para cánceres de cabeza y cuello, no hay estudios acerca de la prevalencia del HPV, no se conoce la frecuencia de presentación de HPV de bajo y alto riesgo oncogénico y se desconoce cuáles son los genotipos de alto riesgo más prevalentes. Tampoco hay estudios en que se demuestre que la interacción de los oncogenes virales E6/E7 con las proteínas p53 y p16 del paciente, favorecería el pronóstico favorable y la mejor sobrevida de estos pacientes.

Nuestra hipótesis de trabajo indica que la presencia de HPV de alto riesgo en las biopsias de pacientes con cáncer de cabeza y cuello tendría una asociación positiva en la expresión elevada de p53 y p16, lo que podría reflejarse en una mejor sobrevida de esos pacientes. Tomando esto en consideración, el objetivo de este estudio es investigar el rol del HPV de alto riesgo y la expresión asociada de p53 y p16 en la presentación, pronóstico y tratamiento de los carcinomas escamosos de cabeza y cuello. Para esto proponemos realizar un estudio retrospectivo de corte transversal analizando 85 carcinomas escamoso de cabeza y cuello y 15 controles sin cáncer de los archivos de la Sección de Patología de la Universidad de Concepción entre los años 2000 y 2010. De esta manera, se validarían los hallazgos de otros estudios y se podría recomendar la detección de HPV dentro de los protocolos de pronóstico y tratamiento de cáncer de cabeza y cuello. 


Análisis fenotípico, genotípico y serotipificación de aislados de Campylobacter spp de diversos orígenes..

Nancy Rivera Fuentes. Magister U.talca. 2008

Resumen

El género Campylobacter está compuesto por varias especies, subespecies o biovariedades y de ellas, las más frecuentes son C. jejuni, C. coli y C. fetus. La infección por Campylobacter constituye una zoonosis, siendo los reservorios principales aves y cerdos, siendo la resistencia a las fluoroquinolonas en aislamientos de Campylobacter spp. de origen animal un problema de salud pública emergente. El principal cuadro causado por C. jejuni/coli es gastroenteritis y por C. fetus, bacteremia. En el presente estudio, se analizaron 21 cepas de Campylobacter spp., obtenidos a partir de deposiciones de origen humano y animal, tanto de Chile como de Perú.

De Chile se analizaron 15 aislados procedentes de Concepción, Santiago y Valdivia ,13 de origen humano y dos de origen animal (aviar) y de Perú se analizaron 6 cepas de origen aviar. La hipótesis planteada fue que las cepas de Campylobacter spp. de procedencia humana y animal presentan resistencia a ciprofloxacino y, que la técnica de RAPD-PCR permite una mejor tipificación de Campylobacter spp. en comparación con la técnica de serotipificación de Penner.

El objetivo general del presente trabajo fue analizar el fenotipo y genotipo de aislados de Campylobacter spp., obtenidos desde diversas fuentes. Los métodos utilizados para la caracterización fenotípica de los aislados de Campylobacter fueron determinación de la sensibilidad a eritromicina y ciprofloxacino mediante el método de la concentración mínima inhibitoria (CIM) por dilución en agar y la serotipificación en base a antígenos termoestables utilizando el método de Penner. Como método de caracterización genotípica se utilizó la técnica de RAPD-PCR. Se encontró un 40% de resistencia a ciprofloxacino en los aislados chilenos de procedencia humana y un 83,3% en los aislados peruanos de origen animal. Sólo una cepa de C.coli presentó resistencia a eritromicina siendo también resistente a ciprofloxacino. La mayoría de los aislados de C. jejuni (87,5%) no pudieron ser serotipificadas por el método de Penner. La técnica de RAPD-PCR permitió genotipificar todos los aislados de Campylobacter spp.

Se concluye que debido a la resistencia encontrada, es necesario realizar estudios de susceptibilidad antibiótica rutinariamente a los aislados de Campylobacter spp., que la serotipificación por el método de Penner no es suficiente para caracterizar aislados de C. jejuni/coli y que la técnica de RAPD-PCR permite caracterizar y analizar todos los aislamientos.


Visítanos

Universidad de Concepción - Chile
Facultad de Medicina | Edificio de Anatomía

2º Piso

Contáctanos

Fono: Fono: 41-2203211
Fax : 41-2203702

Email: labpatologiamolecular@gmail.com
Horario de atención semanal de:

Lunes a Jueves  9 AM - 4 PM, Viernes 9 AM a 13 PM

Sábados y Domingos cerrado